jueves, 19 de enero de 2012

Cultivo in vitro de hongos en agar: experimento

Este es el primer experimento de preparación de medio de cultivo estándar para cultivo de hongos:
El Agar Papa Dextrosa o Agar PDA y un Agar con un aditivo de prueba o Agar Test.

Se preparó Agar PDA siguiendo las indicaciones de la entrada del blog: Medio de cultivo para hongos.
Además se preparó un Agar especial al que se le añadieron ingredientes de prueba (Agar PDA Test).

Objetivos
El Agar PDA es el medio (o uno de los medios) de cultivo universal de hongos. El azúcar proporciona la energía necesaria para que el hongo se desarrolle.
Sin embargo la intención de cultivo de los hongos en este caso no es otra que la de la implantación de semillas de orquídea. La germinación y desarrollo de las semillas es un proceso que puede durar varios meses. Se pretende alargar la vida de los hongos del medio de Agar PDA, de forma  que se asegure una mayor permanencia de los hongos añadidos hasta que el embrión alcance un desarrollo óptimo y más avanzado.

Material necesario
  • El descrito en la entrada Medio de cultivo para hongos
  • 6 botes de cristal  de 8x9 cm con sus tapas
  • 8 Placas de Petri de plástico de 10cm de diámetro
  • Ingredientes para el Agar Test 

Preparación de los frascos
  1. De los 1000 ml de solución resultante de la preparación, se prepararon 3 botes de cristal con tapa amarilla con Agar PDA, unos 3 a 4 cm de altura del bote.
  2. A 300ml de la mezcla de Agar PDA se le añadieron los ingredientes del Agar Test.
    Esta mezcla se repartió entre 3 botes con tapa roja, unos 3cm de altura.
  3. Los botes se colocaron en olla semitapada en constante ebullición unos 30 min, con la tapa sin cerrar del todo y un trozo de papel de aluminio recubriéndola.
  4. Se dejaron enfriar ligeramente y se retiraron de la olla. Se dejaron enfriar unos 30 minutos tras rociarlos con alcohol de 96ºC y taparlos ligeramente con una hoja de papel de aluminio para dificultar su contaminación hasta el cierre de las tapas.
  5. Se cerró por completo la tapa tras un rato de enfriamiento a temperatura ambiente, unos 30-45 minutos, y se dejaron enfriar hasta su utilización.
  6. El resto se utilizó en las Placas de Petri.

Preparación de las Placas de Petri
Todo el proceso se realizó tras haberse lavado las manos y muñecas, con guantes y mascarilla. El espacio se roció con alcohol de 96 º. Debe casi humedecerse las superficies de trabajo al caer el alcohol pulverizado. Normmalmente tras 10-15 segundos de pulverizaciones. (Suele producirse una tos que nos recuerda que el ser humano no respira alcohol, e indicativa de que es suficiente XD).
El vapor del agua al fuego era apreciable en la estancia lo que sugiere buenas condiciones de asepsia.
Las placas se prepararon para comprobar la facilidad de su producción en casa sin que exista contaminación y para su posterior experimentación con siembra y reproducción de hongos de Trichoderma y otros hongos beneficiosos.
  1. Las placas se rociaron varias veces en su interior con alcohol 96º. 
  2. Luego se colocaron al vapor de la olla sobre una rejilla unos 30-60 segundos.
  3. Se llenaron de Agar PDA se y taparon encima del vapor.
  4. Se dejaron enfriar unos 60 min a temperatura ambiente.
  5. Se apilaron las 8 placas sobre papel de aluminio rociado con alcohol de 96º y se hizo un paquete para facilitar moverlas e impedir la contaminación.
  6. Se refrigeraron durante 4 horas.
  7. Se sacaron de refrigeración y se dejan a temperatura ambiente hasta su uso.
Medio de cultivo Agar PDA
El medio resultante tiene un color blanquecino, turbio, lechoso, vidrioso, gelatinoso.

Medio de cultivo Agar Test
El medio de cultivo posee un aspecto compacto, denso, grumoso, apelmazado. El color es blanquecino pero más oscuro, con manchas marrones (¿incorrecto homogeneizado?).

Actualización: 21/01/12.
Se siembran 5ml de solución de jeringuilla estéril en dos botes con similar cantidad de agar, uno Agar PDA y otro Agar test.
Se dejan tapados de la luz en una habitación a temperatura que no suele ser menor de 20 º C (porque soy muy friolero XD)

Actualización: 01/02/12.
Los botes no parecen avanzar. Creo que hay demasiado agua/líquido en la parte superior. El de agar PDA se ha subido (??) y secado extrañamente. Quizá si estén creciendo hongos.
Tampoco sé muy bien que pinta tienen.
Preparo un experimento con Trichoderma harzanium aislada comercial, así que pronto sabré qué pinta tiene y si se parece o no a alguno de los que tenía.

Actualización: 08/02/12.
De momento no hay cambios.
El agar normal se ha resecado y resquebrajado por varias zonas, pero no se ve ninguna modificación que haga sospechar crecimiento de nada. Hay quizá demasiado líquido...
El agar test sigue siendo un pequeño mazacote también sin aparente aspecto de crecimiento de nada.

Actualización: 16/02/12.
Todo igual. O sea nada visible.
Los botes de avena almacenados se han contaminado :( La idea de dos capas de papel de aluminio en vez de tapa es una muy mala idea, se contaminan muuuy fácil.