sábado, 21 de enero de 2012

Siembra de hongos micorriza en agar y coco: experimento

Vamos a probar a sembrar una jeringuilla de 10 ml de esporas de hongos, en dos medios diferentes: unas bolsas con fibra de coco, sin medio nutritivo, y unas placas de Petri de agar PDA para crecimiento de hongos...mucho más apetecible.
La preparación de la jeringuilla para siembra de hongos está en esta entrada. Citar como importante que la jeringuilla está contaminada por cualquier organismo acompañante en el producto comercial.

La jeringuilla se mantuvo unas 24 horas en refrigeración antes de la preparación de las diluciones y siembras.

Procedimiento
Se utilizó una jeringuilla con una dilución primaria de 10 ml, con 0,01 g de esporas.
De ella se tomó 1 ml al que se añadieron 9 ml de agua destilada para hacer 10 ml de solución de esporas con una concentración de 10 exp -1.
Del resultante se volvió a hacer lo mismo siguiendo el procedimiento de diluciones decimales:
Las placas de petri se sembraron por contacto, pasando en forma de una Z sobre las placas de agar, hasta dilución 10 exp -5.
Las bolsas de coco se inocularon con 5 ml de solución, también hasta 10 exp -5.

Para garantizar las condiciones de asepsia se utilizó el vapor de la olla a través de una rejilla sobre la que se trabajó. Las bolsas de coco inoculadas se sellaron inmediatamente con dos trozos de celo en forma de cruz.

Bolsa con fibra de coco antes de se inoculada con las esporas

4 días después (3 y medio).
Se ve una colonia blanquecina de menos de 1cm de diámetro, con un punto verde o negro en su centro...(???).

Placa sembrada en esterilidad:
Placa de petri con hongos micorriza (siembra estéril). La concentración no es conocida.

Placa sembrada (en principio) sin esterilidad:
Placa de petri con hongos micorriza (siembra en principio no estéril). Placa de 10 exp -1

5 días después (4 y medio).
Placa sembrada en esterilidad:
La colonia existente aparece más desarrollada (casi 1 cm de diámetro) y aparece una nueva colonia.

Placa sembrada (en principio) sin esterilidad:
Las tres colonias aparecen más desarrolladas (hasta 2 cm). Aparece una pequeña colonia 

Colonias en detalle


7 días después:
Las bolsas de coco permanecen intactas...no se ve ningún crecimiento...
Así que he inoculado unos 10 ml de solución de sacarosa al 10-15 % en cada bolsa esperando que no sea demasiado tarde para que germinen algunos.

Las bolsas las he colocado juntas en una caja de cartón por la que pasa el cable transformador del portátil XD. Se mantiene una temperatura de 20-25ºC.


17 días después:
Las colonias de hongos siguen creciendo. Han aparecido algunas colonias parecidas a bacterianas, de dos colores diferentes, blanco brillante y ocre. Y una de las placas ha aparecido plagada de nuevas colonias (¿se han reproducido?).
Los hongos (presuntamente micorriza pero sin identificar), presentan círculos concéntricos alternos: blanco y verde.
Se han puesto las placas apartadas de la luz. permanecen a unos 20º C.

Colonias de hongos y colonia sin identificar (flecha roja), de color blanquecino brillante y crecimiento típico de colonia bacteriana.


19 días después:
En esta han crecido dos colonias diferentes: Las de arriba son blancas brillantes. Las de abajo son ocre, marrón. (¿Hongos, bacterias...?)

...Esto es arte

Colonia parda (¿hongo, bacteria, contaminación?)


21 días después:
Las bolsas siguen igual, sin crecimiento de nada. Pero teniendo en cuenta el escaso número de colonias fomradas en las placas y el tiempo que estuvieron con agua pero sin nutrientes, es posible que nunca crezca nada (sigh). Están ahí, pero por estar (por si acaso).
Esto es curioso. Los hongos entre sí parecen no gustarse (flecha 1), se inhiben el crecimiento entre sí (no crece ni uno ni otro).

Otra cosa curiosa...cara "A"...

Y cara "B". Se ve coloración más oscura, ocre, amarillenta, que parece corresponder con la actividad de enzimas oxidasas.

¡Esta es una foto con dos curiosas colonias anaerobia que ha crecido entre la placa y el medio!

Vista por la cara "B"

22 días después:
En 1 continúa la inhibición hongo hongo.
En 2 se señala una colonia (supuestamente bacteriana) que parece estar siendo invadida por el hongo.

En esta sin embargo no hay halo de inhibición entre las colonias... (??).

(1) Colonias blancas. (2) Colonias pardas. (3) Colonias anaerobias creciendo entre la placa y el medio de cultivo.
25 días después:
En el centro de la placa -1 aparecen dos colonias, la blanca/verde en superficie y una semiintroducida en el medio de cultivo, sin inhibirse entre sí. (...?)

En el otro lado de la placa también parece haber "buen rollo" entre colonias.

En esta se muestran las 4 colonias diferentes. La flecha roja es la colonia que crece entre la placa y el medio...por mucho que rasque por fuera, sí. xd. Quizá sea el medio...
Se aprecia la forma de las colonias de flechas azul y verde, con el borde más aplanado.

En el lado opuesto crecen sólo de este tipo. Parecen diferentes a las que crecen en exp -1. Estas son como más algodonosas, redondeadas, sin esos círculos concéntricos.

Y esto, que en teoría no es posible. La placa con la mayor concentración es si no la que menos, no desde luego la que más colonias ha desarrollado.

27 días después:


Estas me da que son contaminación. Por la cara A

Y por la cara B

Esto es nuevo, no estaba hace 2 días.
Ha aparecido una masa filamentosa...(???) Podrían ser hifas del hongo ese que crece anaerobio...tienen misma pinta...

No tengo ni idea, pero estas creo que son colonias viejecitas...quizá "lo verde" corresponda con la parte reproductiva y las esporas. (???)

Cara A...

...y cara B
33 días después:
Desde la placa 1 a la -4:
Las más particulares son la verde oscuro-negra de la parte de arriba. 
Y las dos que se entremezclan a la derecha. No se sabe si son amigas o se intentan comer... De las dos de la derecha la superior es anaranjada. Parece crecer por encima de la otra. (??)

Y por la cara "B", la colonia anaranjada es la que presenta mayor coloración, también más anaranjada-parda

Cara A. Aunque no se ve muy bien sigue la inhibición en las dos colonias de la izquierda, continuaron sin llegara tocarse, al menos aparentemente.(???)

Cara B. Se aprecia algunas colonias de color pardo.



Colonias creciendo entre la placa y el medio.

Esta parece que todos corresponden a la misma especie o similares al menos. Un poco peculiar la forma de las de la derecha, con una masita circular en el centro, una zona sin nada, y una zona circular rodeándolos.
Por la cara B se ve oxidación en las colonias más grandes.

Esto es un "zoo". 
Las flechas rojas son colonias que NO crecen hacia el medio de cultivo, sólo en superficie.
La flecha azul y el resto de colonias crecen introduciéndose en el medio de cultivo claramente, con aspecto más o menos algodonoso, o circular casi perfecto o con forma de masa circular.
Los números indican colonias claramente distintas entre sí. 
Las dos colonias 1 son colonias que no crecen hacia dentro pero han crecido aisladas en otra masa de colonias que sí se introducen en el medio de cultivo. (mmmmm)

Y por la cara "B":
Los colores son los colores de las colonias por debajo. Excepto las coloreadas el resto es blanquecina. Unas crecen redondas casi perfectas (más evidente en la mitad inferior derecha) y otras en forma algodonosa de nube e irregular (la mitad superior izquierda).
Las de color más intenso y notable son las de abajo amarillo-anaranjado y la de arriba verde-negro.
La verde negro es una cosa rara: es una esfera verde-negra casi perfecta rodeada de una masa blanquecina que se introduce sólo parcialmente en el medio de cultivo.
El resto de colores son bastante suaves en la placa.
El círculo rojo es una colonia prácticamente redonda perfecta creciendo entre el medio y la placa, es transparente con el borde blanquecino.