viernes, 10 de febrero de 2012

Cultivo de hongo Trichoderma harzianum: experimento

Tras hacerme con un producto puro de Trichoderma harzianum, voy a hacer un cultivito en dos placas de petri que me han sobrado del experimento del Cultivo de alubias en medio estéril.

Trichoderma harzianum es uno de los micorrizas más estudiados.

Del resto del agar del anterior experimento he separado dos placas de petri.
Básicamente contiene un 10% de dextrosa, 10% agar, y la sustancia de "Descubrimiento 1". Nada más.

El preparado comercial indica una concentración de 10 exp 8 ufc/g. 100 millones de esporas por gramo.

Preparación
Espacio pulverizado de alcohol, manos lavadas hasta los codos, mascarilla, mechero encendido...
  1. Usaré 0.01g de esporas.
  2. Se cubren de alcohol cerca de la llama para desinfectarlas y se deja evaporar el alcohol.
  3. Se diluyen en 10 ml de agua bidestilada
  4. Y sembraré por por agotamiento, con estrías.
  5. Dejo a unos 20-25 ºC.
  6. A esperar...
Jeringuilla con solución de esporas

3 días y medio después
En una placa han aparecido decenas de colonias, que no siguen (o no parecen seguir) la siembra por agotamiento. Y la otra placa permanece intacta. (??)
Las colonias son muy muy blancas, con aspecto pulverulento.

Cara A
Cara B
4 días después
Han crecido un poco más. Se me ocurre que puede la placa en la que han crecido si puede corresponder con siembra por agotamiento, sólo que estaba demasiado concentrado.
Y en la placa de momento sin crecimiento, sólo se me ocurre una cosa: que haya frito todas las esporas por tener el asa demasiado caliente. Pero me parece raro, no suelo meter la pata en frituras de cultivos...¿ y todas? Seguiré esperando, a lo mejor se están preparando y cuando salgan verás XD.

5 días después

Una de las placas continua el crecimiento y en la otra nada. 5 días sin crecer nada...creo que se puede confirmar que no va a crecer nada y si lo hace será contaminado. Se ve que sin querer "las freí" con el asa de siembra :(
Lo que me parece más curioso es el crecimiento elevado, más alto en el centro y bajo en el borde, en forma de cúpula.Y las colonias más aisladas han alcanzado mayor tamaño.

Colonias de Trichoderma harzianum
Colonia de Trichoderma harzianum bien desarrollada, en forma abovedada.

Por cierto a estas alturas no veo mucho parecido con los hongos cultivados en el experimento de siembra de hongos micorriza en agar y coco.

6 días después



7 días después
Las colonias siguen creciendo pero las formas abovedadas casi perfectas se han deshinchado. El color blanco ha pasado a ser más grisáceo. Parece que en el centro de algunas hay un punto oscuro, verde-negro (???).
Parece que hay una colonia diferente al resto. Aunque es pequeña no parece que oxide el medio como el resto de colonias.Estaría bien sacarla de ahí y cultivarla sóla a ver...

Hay una colonia un poco diferente (flecha roja). Se aprecia sobre todo en la otra cara porque no produce oxidación del medio de cultivo:

Experimento con la Placa 2.
Como tras 7 días no ha crecido nada, he probado a hacer una siembra en agotamiento de las micorrizas "variadas" que tenía. Así que he bañado en alcohol unas pocas de esporas y he dejado evaporar cerca de la llama. He añadido un poco de agua destilada y he sembrado directamente en la placa con el asa. Y a esperar.


9 días después
Las colonias siguen creciendo pero las más viejas han empezado a volverse verduzcas. (esporulando???). Las colonias con espacio suficiente siguen creciendo.
He quitado una para cultivarla sola en una placa y hacer más experimentos (círculo azul). Es curioso porque aunque parece que no se introduce mucho en el medio, sí me costó arrancarla, y aún así quedó un trozo de "raíz".
La flecha roja es la colonia que no oxida el medio


Esta es la placa 2 con la colonia "trasplantada":

10 días después
Las colonias se vuelven más verdes.
La otra trasplantada sigue creciendo a toda velocidad :)



Y la colonia trasplantada, como tenía "raíz", se reproduce :)

11 días después


Y la placa "trasplantada":
La flecha verde es una colonia pues eso, verde, completamente diferente en aspecto a las otras y casi seguro una contaminación.

12 días después:
Agité la placa trasplantada con la intención de diseminar por toda la placa los hongos y esporas, y parece que ha dado resultado.

13 días después:
He "extirpado" la "presunta" colonia de hongo desconocido, con unas pinzas flameadas a la llama, medio friendo el medio (sin miedo), para aprovechar y sembrar una semilla.
He humedecido por fuera unos segundos una semilla de manzana y la he dejado luego unas 4-6 horas en agua destilada.
Y la coloco en el agujero.
Todo el proceso sin mucha atención a la asepsia ya que la semilla no la he desinfectado por ningún medio más que externamente y ligeramente con alcohol.


Semilla de Malus domestica en placa con hongos Trichoderma harzianum
14 días después:
Semilla de Malus domestica en placa con hongos Trichoderma harzianum

Oxidación del medio de cultivo por Trichoderma harzianum
Esta con la luz incidiendo en el medio de cultivo se ve las hifas del hongo introducidas mezclándose en el medio y formando un halo.

Esta es la placa en la que sembré primero (ni me acuerdo) pero no creció nada.
Luego probé una siembra de la mezcla comercial de micorrizas. Y tampoco.
Así que he tomado una pizca con unas pinzas flameadas y lo he colocado en el centro. Y sólo en un día:
Claro no es lo mismo que germine que se extienda, que tarda mucho menos.

15 días después:
La semilla de manzano ha sido infectada primero con el micelio blanquecino, luego ha empezado a volverse verde, sin que se aprecie ningún cambio en la semilla.