viernes, 21 de junio de 2013

Cultivo de Aspergillus oryzae

Cultivo de Aspergillus oryzae

En esta entrada voy a intentar cultivar un hongo que me han enviado :) 
El Aspergillus oryzae. Es un hongo bien preciado en cocina japonesa.
Se usa para fermentar soja y obtener salsa de soja.
También en el sake y el shochu, amazake -una bebida fermentada ligeramente alcohólica- y miso.

Características y morfología de Aspergillus oryzae

Al comenzar su desarrollo las colonias son blanco-amarillentas, y luego se convierten en amarillo verdosas o de color castaño.

Puede tener una o dos filas con conidiosporos piriformes.
Los conidióforos son estructuras formadas a partir de hifas, que porta células conidiógenas productoras de conidios o esporas.
Conidióforo de Aspergillus oryzae
Produce amilasas, proteasas, y ácidos kójico.

El koji se cultiva sobre arroz cocido al vapor, refrescado e inoculado con las esporas del Aspergillus oryzae. Entonces es incubado de 3 a 4 días a 42ºC. Cuando el koji está listo para la cosecha se observa una lana blanca como el algodón cubriendo completamente el arroz.

Experimento: Multiplicación de Aspergillus oryzae

Me han enviado el hongo inoculado en arroz, una de las formas como se suele cultivar.

Puesto que necesito esporas para hacer pruebas, voy a intentar que esporule primero. Para ello hay que dejar que termine su ciclo. También se puede forzar con cambios bruscos de temperatura (por encima de 35ºC).

Primero quiero que se reproduzca todo lo que pueda.
Para ello estoy rehidratando la pequeña muestra con:
  • agua destilada, 
  • una punta de levadura
  • una pizca de mi "Sustancia mágica" -con presunta capacidad de hacer crecer más los hongos-
  • unas gotas de mezcla sobresaturada de antibiótico: amoxicilina + ácido clavulánico
En total, menos de 2 ml de solución enriquecida para un tamaño de arroz de una cucharada sopera.

En lugar de una placa de Petri he utilizado una cajita cuadrada transparente de unos 5cm, que permite el cierre casi hermético.

La muestra que me envían parece estar en muy buen estado, ha tardado dos días en llegar.
El hongo es blanquecino, lo que sugiere que aún está vivo, activo y aun no ha empezado a esporular.

21 junio 2013. Madrid. T= 25 ºC
Aspergillus oryzae siendo rehidratado

Aspergillus oryzae siendo rehidratado

Aspergillus oryzae siendo rehidratado

El proceso de crecimiento a unos 25-30º C  dura unos 12 días, siendo el día 13 al 15 los días de máxima producción de ácido kójico, una de las sustancias carcaterísticas que produce este hongo.

Una vez finaliza su ciclo vital y/o empieza a esporular, el hongo se torna verdoso.
En ese momento se debe desecar lo antes posible (por ejemplo al sol) para estimular la máxima producción de esporas y la ausencia de humedad en el resultado, que se usará para sembrar las próximas muestras.

22 junio 2013. Madrid. T= 25 ºC. 12h

Llevan unas 12h pero la caja que los contiene aparece con condensación: ¡¡los hongos están vivitos y están respirando!!
Además se aprecia cierto olor a fermentado: ácido, avinagrado, con olor intenso a manzana/sidra.
Aspergillus oryzae a las 12h

Aspergillus oryzae: Detalle de la condensación.

Aspergillus oryzae a las 12h

23 junio 2013. Madrid. T= 25 ºC. t =24 horas

El nuevo micelio del hongo empieza a ser claro en sólo este día transcurrido.
Se ve cambio desde las fotos anteriores, sólo unas 6 horas antes.
El color amarillento de los granos de arroz es debido a las sustancias que he añadido al líquido inicial.
El olor es que desprende es ácido, alcohólico, con olor a manzana, mosto o sidra. 

Aspergillus oryzae a las 24h

Aspergillus oryzae a las 24h
24 junio 2013. Madrid. T= 26 ºC. t =48 horas

Tras 48h el hongo ha cubierto por completo el medio de cultivo de arroz.

El olor ha cambiado y ya no es tan afrutado a manzana/mosto/sidra. Ahora huele algo más a queso.

Supongo que seguirá creciendo un poco más, uno o dos días, y a partir de ahí empezará a declinar y con ello esporular.
Aspergillus oryzae a las 48h

25 junio 2013. Madrid. T= 26 ºC. t =72 horas

Tras 3 días el hongo sigue cubriendo por completo el medio de cultivo de arroz.
A excepción de unos granos aislados que se han quedado como rezagados y en los que apenas ha crecido el hongo y que voy a apartar.

Sí parece que su aspecto ahora es más aterciopelado, como si tuviera múltiples pelitos.

El olor sigue siendo más a... ¿queso? Desde luego no afrutado como el primer día.

Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae, detalle

Aspergillus oryzae, vista por debajo de la placa de cultivo
26 junio 2013. Madrid. T= 26 ºC. t =4 días

No hay muchos cambios con respecto a ayer. 
El hongo no ha cubierto más lógicamente porque no dispone de sitio. Eso precisamente debería hacer que en breve termine su ciclo de crecimiento (si no lo ha hecho ya) y comiencen a producir esporas. Entonces se volverán verdes, según parece. No obstante cualquier cambio a otro color (gris, negro) será a tener en cuenta :)

Una pequeña parte  -unos granos-se ha secado. Espero que no contaminada por otro hongo. Si veo que tal los apartaré con el resto de granos "raros". Tampoco parece que sea porque el hongo haya terminado su ciclo vital. Quizá tengan demasiada concentración de los nutrientes líquidos que añadí, por ser granos sueltos que se empaparon por completo y antes que el resto que permanecía en bloque...

El olor sigue siendo el mismo, el color y aspecto también.
Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae. Granos contaminados puestos a parte


27 junio 2013. Madrid. T= 26 ºC. t =5 días

Primeros cambios.
El olor no es tan agradable como antes y se vuelve más "alimento estropeado".
Lo más novedoso es la aparición de una zona de aspecto de pelusa blanquecina: los órganos reproductores.

Aspergillus oryzae. Inicio de la esporulación

Aspergillus oryzae. Inicio de la esporulación

Aspergillus oryzae.Granos apartados

Aspergillus oryzae. Vista del medio desde abajo.


28 junio 2013. Madrid. T= 26 ºC. t =6 días

Novedades: el hongo ha empezado a esporular. Más concretamente ha empezado a desarrollar las estructuras de fabricación de esporas: esos pelillos típicos que preceden al oscurecimiento a verde-negro.

Aspergillus oryzae. Condensación de la caja

Aspergillus oryzae. Masa blanquecina desarrollándose

Aspergillus oryzae. Masa blanquecina detalle

Aspergillus oryzae. Masa blanquecina detalle
Aspergillus oryzae. Detalle

29 junio 2013. Madrid. T= 27 ºC. t =7 días

La mas más filamentosa parece haberse difuminado. 
Han aparecido un montón de pequeños filamentos en posición vertical, coronados por una estructura diferente, ¿más brillante?.
También se observa alguna gota... no sé muy bien si de condensación o de alguna sustancia producida por el hongo (?).
Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae


30 junio 2013. Madrid. T= 27 ºC. t =8 días

Siguen apareciendo estructuras filamentosas transparentes, coronadas por curiosos pequeños puntos blanquecinos.
Prácticamente cubren todo el área del medio de cultivo de arroz del área derecha, por donde empezó esta colonización. En el área izquierda aún no se ha formado por completo.

Cabe destacar que el olor ahora es casi....nulo. 
Ni a estropeado, ni a rancio, ni a queso, ni afrutado.
No huele a nada prácticamente. 

Aspergillus oryzae

2 julio 2013. Madrid. T= 28 ºC. t =10 días

El color blanquecino se ha tornado algo más oscuro.
Destaca en la caja la ausencia de tanta respiración como en la fase de desarrollo del hongo: casi no hay vaho.

Aspergillus oryzae. Detalle del contenedor con casi ausencia de vaho por respiración

Aspergillus oryzae. Detalle

Aspergillus oryzae. Parte de abajo del contenedor.



 4 de julio 2013. Madrid. T= 28 ºC. t =12 días

Apenas hay cambios.
Aparece alguna mancha más oscura, verdosa-negra. No sé si por contaminación.
Podría porque es diferente al resto. Pero a la vez es raro que sea en un área tan adentrada y no en un borde.
La respiración y el vaho en el contenedor de cultivo es aún menor comparada con la foto de dos días anteriores.
Aspergillus oryzae. Detalle del contenedor con casi ausencia de vaho por respiración

Aspergillus oryzae. Detalle de la mancha verde oscura
10 de julio 2013. Madrid. T= 30 ºC. t =18 días

El día 4 finalmente separé los hongos en dos, el posible contaminado y el normal.
Para ello usé una cámara casera estéril, elaborada con una caja de plástico de almacenaje y unos guantes de goma. Todos los detalles para elaborar una cámara casera estéril en la entrada Recoger semillas de Phalaenopsis

Finalmente ha parecido ser una decisión acertada. La mancha del posible hongo contaminante ha aumentado.
Por otro lado, el hongo separado, se ha mantenido intacto en su color, y no posee manchas extrañas.

Aspergillus oryzae. Ejemplar separado no contaminado.

Aspergillus oryzae. Detalle del ejemplar separado no contaminado.

Aspergillus oryzae. Ejemplar separado y posiblemente contaminado.

En cuanto al aspecto del hongo se refiere apenas hay ningún cambio visible, y quizá terminara de esporular hace ya varios días.