viernes, 21 de marzo de 2014

Como germinar semillas de Phalaenopsis: Experimento (fallido)

Germinar semillas de Phalaenopsis: Experimento

Voy a intentar germinar in vitro semillas de orquídea Phalaenopsis. Estas semillas las obtuve de una de mis orquídeas. Los detalles en la entrada Recoger semillas de Phalaenopsis.

En realidad germinar semillas de orquídea in vitro es una tarea extremadamente difícil.
Germinar desde semilla una orquídea está reservado sólo a expertos biólogos, con laboratorios equipados y material disponible tanto de laboratorio como reactivos y sustancias nutrientes para los medios de cultivo.

Además para hacerlo más difícil, parece que las variedades de orquídea autopolinizadas -como es mi caso- poseen un índice muy bajo de germinación.

A todo ello hay que sumarle la dificultad de preparar los medios de cultivo, evitar la contaminación, permitir el trasplante de las plántulas sin contaminarlas, etc.

Sin embargo, puesto que he tenido una idea muy buena para un medio de cultivo que curiosamente no veo se haya utilizado nunca :) , me he decidido a usar mis semillas en este experimento.

Semillas de Phalaenopsis. Cultivo propio.

Material necesario

  • Semillas de Phalaenopsis
  • Agua oxigenada
  • Agua destilada estéril
  • Jeringuillas con aguja, mejor una grande (de al menos 20ml y otras de 5ml)
  • Un papel de filtro redondo de cafetera o un trocito de algodón
  • 200 ml de "Solución M"
  • 1,5g agar agar
  • Film transparente

Preparación

Lavarse bien las manos hasta casi los codos, pulverizar alcohol en el área de trabajo, evitar corrientes de aire y usar guantes de látex. Si tienes el pelo largo recógelo perfectamente. Usar mascarilla y gorro para el pelo no es tampoco mala idea. Ninguna precaución es poca.
Trabajar siempre cerca de una fuente de calor, como un fuego de la cocina, o una olla con agua hirviendo sobre la que se ha colocado una rejilla en la que se trabaja. Un mechero de alcohol en la zona de trabajo también es necesario.

He colocado 200ml de solución "M" en Erlenmeyer a hervir para esterilizar.
Tras unos 10-15 min casi tapado por completo, he añadido 1,5g de agar agar.
Lo ideal es taparlo y dejarlo unos 2 ó 3 días para asegurarse de que no crece nada que no debiera.

Para proteger al máximo el medio de cultivo, yo lo he cocinado tapado con dos capas de papel de aluminio y una vez fuera del fuego lo he protegido con un bote desinfectado con alcohol colocado encima al revés, y envuelto todo en film transparente, hasta que se ha enfriado.



Medio de cultivo para semillas de Phalaenopsis
Detalle del medio de cultivo para Phalaenopsis

Por otro lado se prepara la jeringuilla en la que esterilizaremos las semillas. Elige una de al menos 20 ml.
Tras extraer el émbolo introduce las semillas con sumo cuidado, con unas pinzas por ejemplo.
Tapa el extremo y vuelve a introducir el émbolo con cuidado de que las semillas no se escapen.

Jeringuilla con las semillas
A continuación (o justo antes para evitar que se escapen), coloca un filtro de papel de los de café recortado entre la jeringuilla y la aguja. No hace falta que metas toda la jeringuilla en la aguja, ya que el papel hace que sea más difícil.
Esto permitirá que no se escapen las semillas al aclararlas.

Jeringuilla preparada con las semillas y el papel de filtro -entre jeringa y aguja-

Detalle de la jeringuilla insertada en la aguja con el papel en el medio


Existen dos métodos para esterilizar las semillas de orquídea:
  1. Con agua oxigenada, al 30% 10-15 min y lavarlas unas 3 veces
  2. Con lejía, hipoclorito de sodio en solución de un 10% de lejía, un 90% de agua y una gota de jabón, de 5-10 minutos.

Con el método de la lejía es más sencillo pasarse y quemar las semillas. El del agua oxigenada es menos eficaz pero inactiva algunas semillas.

Se esterilizarán con 30% de agua oxigenada, por lo que tomaremos 7 partes de agua destilada y una de agua oxigenada, o lo que es lo mismo, para nuestra jeringuilla de 20ml, 7ml de agua y 3 de agua oxigenada. Debemos tomar primero el agua destilada, cerca de la llama del mechero, y por último el agua oxigenada. Hacerlo al revés podría quemar las semillas.

Luego se agita bien la jeringuilla y se deja unos 10 a 15 minutos.

Se vacía la jeringuilla y se lava con agua destilada 3 veces. Es importante trabajar cerca de la llama del mechero y flamear o quemar la aguja ligeramente cada vez que se toma agua destilada, para esterilizarla.
Al final dejamos la jeringuilla envuelta en film transparente a la luz del sol para descomponer el agua oxigenada que pudiera quedar en la jeringuilla.

Se dejan unas gotas, más o menos dependiendo de nuestra cantidad de semillas y la superficie del medio a cultivar.
Estas gotas serán las que sembraremos después de quitar el papel de filtro para permitir que salgan las semillas.
Es importante tener en este momento mucha precaución, trabajar en zona limpia, usar guantes, cerca de una llama o sobre una rejilla en una olla con agua hirviendo que permita un área de vapor donde trabajamos, usar guantes, evitar corrientes de aire y limpiar o desinfectar la jeringuilla ya que la introduciremos en el medio de cultivo estéril.
Después se tapa de nuevo el medio de cultivo y se deja en una zona ligeramente luminosa pero no directa al sol. Y...esperar lo poco probable: que crezcan pequeñas Phalaenopsis.

Actualización 31 de julio de 2013.
El matraz con el medio de cultivo y semillas han permanecido en el alféizar de la ventana, a la sombra pero en claridad (¿quizá no suficiente?).
La temperatura exterior ha sido de unos 28-30ºC de día y unos 25ºC de noche, con dos días aislados de tormenta y temperaturas menores (hasta 21º de noche).

El medio se mantiene intacto, exactamente igual que al principio.
Esto no debe interpretarse (aún) como un fracaso.
Las semillas pueden tardar MESES en germinar... zzZZZ

Mientras no se contamine el medio interno y se pueda mantener temperatura y claridad, hay esperanza.

Como son algodonosas, se han adherido todas en dos masa principales, una sobre el medio de cultivo, sin agua, y otra en un borde que ha quedado sumergida en agua.

Así pruebo si alguno de los dos responde antes.

Semillas de Phalaenopsis ssp.

Semillas de Phalaenopsis ssp.

Actualización 10 de septiembre de 2013.
El matraz con el medio de cultivo y semillas siguen sin cambios. No hay contaminación del medio de cultivo, pero no se percibe ninguna actividad.

He colocado el Erlenmeyer inclinado, de forma que el líquido quede en un lado y las semillas algodonosas pegadas al medio de cultivo.

Con ello intento que no estén sumergidas en agua, que quizá no sea ninguna buena idea.
Desgraciadamente en Madrid comienza el otoño...poca luz, frío...
Posiblemente no tengan posibilidades hasta el comienzo de la nueva primavera...

Las semillas son las de aspecto algodonoso. Los trocitos son parte del medio de cultivo "secreto".


Actualización 19 de noviembre de 2013.
Todo igual.
Sin crecimiento pero sin contaminación del medio de cultivo -al menos-.
Está en la ventana, pero en una ventana orientada al norte, con poca luz.
La temperatura en Madrid ha sido suave hasta hace pocos días 12-15º C. Pero los días y las noches ya se han hecho frías: 2-8 ºC.
Supongo que hasta primavera -siempre y cuando no se contamine-, no podré esperar nada.

Actualización  19 de diciembre de 2013.
El medio de cultivo en el Erlenmeyer sigue incorrupto: no hay contaminación microbiana.
Pero las semillas tampoco parecen activarse.
He decidido envolver el matraz y dejarlo en lugar oscuro hasta un poco antes de la primavera.
Así pretendo que las semillas crean que ahora es invierno cerrado (lo cual es cierto) y que hacia febrero los días les marquen si deben o no germinar y cuándo. Sea primavera o verano.

Actualización  13 de febrero de 2013.
El medio de cultivo sigue sin contaminarse lo cual es bueno.
Se ha sacado de la oscuridad y se ha puesto en la claridad de una ventana, con una temperatura de unos 12-15 ºC.

El medio de cultivo contiene pequeños trocitos. Las semillas se encentran en dos partes, la que se ve en la imagen, que agrupa una zona algodonosa, y otra masa grande que está sumergida en la parte líquida del medio de cultivo.

Actualización  21 de marzo de 2014.
Inicio de primavera. No hay cambios.
Las semillas no parecen cambiar.

Actualización  25 de agosto de 2014.
Nada.
El medio de cultivo estéril pero sin actividad alguna.
Voy a probar a intentar añadir Trichoderma y confiar en que no se contamine en el proceso, que el medio de cultivo sea óptimo -como espero- y a ver qué pasa.
Vista del medio de cultivo con las semillas en círculo rojo, tras más de 1 año.



Actualización 1 de septiembre de 2016.
Tras más de 4 años, no hay ningún cambio, así que creo que es momento de dar por terminado el experimento.
De todas formas probaré el mismo medio de cultivo con semillas fáciles a ver si el medio de cultivo vale en otros casos.

El medio de cultivo, eso sí, ha permanecido estéril durante todo este tiempo.